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测量生物发光共振能量转移
发布时间:2018-01-19   点击次数:348次

fff简介分子之间的能量转移大多是由辐射导致的。然而当不同荧光物质非常靠近时(<10nm),会发生共振能量转移(RET)。荧光共振能量转移(FRET)是一种的型的 RET现象。

1 所示在 FRET 中,使用强光照射以激发供体能量,处于激发态的供体将一部分或全部能量转移给

受体,受体被激发。如果受体荧光量子产率为零,则发生能量转移荧光熄灭;如果受体也是一种荧光发射

体,则呈现出受体的荧光。光照下很多荧光物质会逐渐失去其荧光特性,这种现象被称为光漂白。为了提高灵敏度,近期生物发光共振能量转移(BRET)得到了广泛应用1BRET使用生物发光物质代替了荧光供体。由于BRET不在需要直射光线以激发供体,不存在放射性的能量转移,所以避免了对样品的损害(如图2)。荧光素酶是一种萤火虫体内的生物发光酶,被广泛用于 BRET研究2。本实验中,选择Luc8(海肾荧光

素酶)作为供体(图3),该物质由海肾(Renillareinformis)基因突变而来。如图4所示,Luc8 的生物

荧光峰值接近480nm

2BRET示意图

3:海肾(左)和Luc8蛋白结构(右)

4Luc8的发射光谱右)

本实验中,使用了四种类型的量子点(605655705800):它们具有高量子产率,并适用于多种荧光波长(图5)。这些量子点在较大的波长范围内都有吸收,但是在605655705800nm时发出的荧光较强。

5:量子点的结构(左)和荧光(右)

发光强度相对于强光直射产生的荧光强度较弱,同时使用微量比色皿获得的光量较小。为了在测量 BRET时能够更加高效地收集光,本实验使用了发光微量池支架,该配件可zui大程度减少微量池与发射透镜之间的距离(图6)。

试剂和仪器

1.Lumina荧光分光光度计

2.发光微量池支架

3.PBS缓冲液0.1MpH 7.4

 4.Luc8 150 M

5.量子点605655705800 8 MInvitrogen

6.腔肠素H 1 g/ l 甲醇溶液(Promega

7.NiCl2 100 M 蒸馏水溶液(Sigma Aldrich

8.10 l 微量离心管 

9.45 l 荧光微量池

10.吸液管和吸液头

11.涡旋混合器

实验步骤

1.准备410 l 微量离心管。

2.在每个离心管内填充94 l PBS 缓冲液和 1 l Luc8供体)。

3.在每个离心管中添加5 l量子点605655705800(受体)。

4.在每个离心管中注入2 l NiCl2溶液(供体和受体之间的结合试剂),并在充分混合。

5.将发光微量池支架安装到Lumina上,注入样品并插到支架上。

6.打开Luminous WaveScan 软件,输入设定参数,点51击应用(Apply)(图7)。

7.使用吸液管注入2 l腔肠素H,迅速合拢测试舱盖,点击开始按钮。

8.应用基线校正功能对测得的光谱进行校正。单击基线校正(Baseline Correction)图标,使用具有zui低生物发光强度的波长进行基线校正(图8)。

9.根据Luc8峰值对光谱进行标准化校正,比较量子点峰值。为了标准化,计算各个转换标量,使得所有Luc8峰值强度相等。然后单击标量计算器(Scalar Calculator)图标,通过乘以转换标量对其进行标准化转换(图9)。

仪器参数

7:波长扫描测量条件

8:基线校正窗口

实验结果

从测得的光谱上,可以观察到BRET现象,Luc8与各量子点发生了生物发光能量转移(图10)。由于多重量子点结合可在单个波长条件下产生多种波长,因此使用量子点的BRET对分子诊断和成像领域均有很大助。BRET 能量转移的效率的因素有:(1)供体和受体之间的间隔距离;(2)供体发射和受体激发光谱的重叠。通过比较使用Luc8峰值进行标准化校正的光谱,我们可以证实量子点665-Luc8结合物在多个结合物中产生的BRET效率zui高

实验结论

Thermo Fisher公司的Lumina荧光分光光度计和发光微量池架配件有助于检查BRET,其产生的噪音要小于FRET。此外,实验证明根据量子点发射波长的不同,BRET现象可应用于较广的波长范围。

 

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