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荧光分光光度计 测量寡核苷酸的熔解温度
发布时间:2018/1/18   点击次数:246次

简介

在生物化学领域中,生物材料的热学性能研究是材料分析的重要组成部分。而熔解温度(TM)是生物材料中应用最广泛的热学性能。生物材料由许多化学键组成,随着温度的升高,材料内能增加同时化学键断裂。这种因化学键断裂而导致生物材料结构改变的现象被称作热变性。此外,最活跃时的变性温度被称为熔解温度。熔解温度是用于表征材料稳定性的指标之一。寡核苷酸是一种遗传物质,由多组碱基构成。寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接,所以常用来作为探针确定DNARNA的结构,经常用于基因芯片、电泳、荧光杂交等过程中。如图1所示,我们将Alexa Fluor® 488 荧光探针标记在寡核苷酸的  端部,将Alexa Fluor® 532 荧光探针连接在另一端。

 

本实验采用Thermo Fisher公司的lumina荧光分光光度计配备 Peltier 温控系统(图2)对不同温度下的荧光性能进行了测量。Peltier温控系统可快速精准地对温度进行调节,温度范围可控制在-10℃到100℃。该系统有样品除霜功能、磁力搅拌功能和温控功能。本研究采用 Lumina 和 Peltier系统,结合荧光标记,研究了寡核苷酸荧光强度与温度的关系。最终根据一阶导数分析熔点曲线并计算出了TM 值。

2Peltier 系统配件(单池池架(a)、4 联池池架b)、Peltier 控制模块(c))

试剂和仪器

1.Lumina荧光分光光度计 

2.Peltier 控制模块、单池池架

3.供体寡核苷酸5´  – (Alexa 488) – ACCGTGAGCA – 3´

4.受体寡核苷酸

5´ – (Alexa 532) – TGCTCACGGT – 3´ 5.Tris-EDTA 缓冲液(pH 8.0

6.NaClACS 试剂,≥99.0%

7.10ml 塑料管

8.荧光比色皿

实验步骤

1.添加 10ml  Tris-EDTA 缓冲液(pH 8.0)到两根塑料管中,形成浓度分别为172mM(供体)190mM(受体)的NaCl溶液。

2.在上述缓冲液中溶解供体/受体寡核苷酸,使浓度变900nM

3.混合已制备的供体试剂和受体试剂,然后在室温下培养5分钟。

4.Peltier系统安装在 Lumina上。5.打开LuminousThermal软件,如图3输入预定参数。使用软件(Excel®, Origin®等)根据供体各测量点数据计算一阶导数,并在测量后查看TM 值。

仪器参数

3Thermal软件测量条件

实验结果

FRET 现象是供体到受体的一种能量转移现象,这是由于荧光物质受热前荧光探针间距离较短造成的。因

此,在供体激发波长519nm处发出较弱的荧光,在受体的激发波长553nm处发出较强的荧光。另一方面,

随着受热产生的热变性现象,与FRET现象相反。换句话说,荧光在519nm时较强,而在553nm时较弱(4)。

4:受热前(左图,25℃)、受热后(右图,55℃)热变性荧光强度如图5所示,我们绘制了供体、受体荧光强度与温度的关系。可以确认,供体和受体上发生的荧光强度逆转的情况是由于 FRET 现象消失导致的。

5:供体、受体荧光强度与温度的关系

目前有多种方法可以确定TM 值,本实验中我们通过一阶导数的峰值来确定TM 值。本次试验所用寡核苷酸的TM 值为49℃。(图6

6:荧光强度随温度而改变

实验结论

本研究中,使用Thermo Fisher公司Lumina荧光分光光度计和Peltier 温控系统,研究了温度变化对寡核苷酸荧光强度的影响。此外,根据实验数据计算出代表材料安全性的TM 值。

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